Kuni 1983 aastani oli võimalik uusi taimeliike saada vaid klassikalise sordiaretuse läbi. Esimene
geenitehnoloogia abil loodud taim (tubakas) valmis aastal 1983. Aastaks 2013 on geenitehnoloogia abil loodud taimed olnud tööstuslikus kasutuses juba 16 aastat (www.isaaa.org/). Selle ajaga on on toimunud 87-kordne kasv tootmispindade alal (1,7 miljonilt hektarilt 148 miljonile hektarile). Kokku kasvatatakse GM taimi tööstuslikult 29 riigis.
Geenitehnoloogia abil uute omadustega taime loomiseks on vaja läbida 5 etappi:
1. DNA eraldamine
Kui on tuvastatud huvipakkuva omaduse (näiteks herbitsiidi resistentsuse) eest vastutav geen, siis on vaja sellest organismist eraldada kogu DNA või RNA. Alternatiiviks on kasutatada arvuteid ja moodsaid DNA sünteesi masinaid ning sünteesida DNA ise. Viimase võimalikkust on näidanud C. Venter, kes sünteesis mükoplasma (Mycoplasma genitalium) DNA (Gibson et al 2008).
2. Huvipakkuva geeni kloneerimine ehk viimine kandjamolekuli
Eelnevas etapis saadud DNA-st lõigatakse restriktsiooni ensüüme kasutades välja üks konkreetne geen, mis vastutab konkreetse tunnuse eest. See DNA lõik 'kleebitakse' vektorisse. Vektor on DNA molekul, mida kasutatakse geneetilise materjali kandjana. Vektoreid on neli tüüpi:
3. Geeni ekspressiooni disain
Vastavalt soovitud eesmärgile on võimalik ära määrata geeni ekspressiooni muster taimes: millal ja millistes taime osades ning millises mahus toimub valitud tunnuse ilmnemine. Seda tehakse promootori abil.
--Promootor - DNA lõik, mis määrab ära geeni ekspressiooni aja ja koha.
Konstitutiivne promooter – ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.--
Valikuline promooter – ekspressioon toimub ainult teatud taime arengu faasides, teatud taime kudedes või sõltub ekspressioon välistest teguritest.
—Tugevad ja nõrgad promootorid – mõjutavad ekspressiooni kogust (valgu hulka taimes)—.
Selleks, et oleks võimalik jälgida sisseviidava geeni liikumist taimes on vaja veel kahte DNA lõiku: markergeeni ja reportergeeni.
Markergeen - DNA lõik, mille alusel saab otsustada, kas huvi all olev geen on teise organismi kandunud. Klassikaliselt on selleks antibiootilist resistentsust tagavad geenid (näiteks ampitsilliini või kanamütsiini resistentsuse geenid). Aga kuna meditsiinis kasutusel olevate antibiootikumide resistentsuse geeni levik looduses võib tekkida probleeme, siis suund on võtta kasutusele teisi markereid. Näiteks kasutatakse herbitsiidi resistentsuse geeni või taime ainevahetuse geene (phosphomannose isomerase, xylose isomerase etc).
Markergeen viiakse huvipakkuva geeniga samas vektoris taime rakkudesse. Rakud pannakse kasvama antibiootikumi või herbitsiidi sisaldavasse söötmesse ja need mis jäävad ellu, on tõenäoliselt edukalt üle võtnud nii marker geeni, mis andis rakkudele resistentsuse, kui ka huvipakkuva geeni.
Juba suureks kasvanud taimes on vaja samuti kontrollida, et huvipakkuv geen oleks taimes ning et geen oleks funktsionaalne (valgu süntees toimiks). Sellise kontrolli võimalust pakub reportergeen.
Reportergeen - DNA lõik, mille ekspressiooni on võimalik taimes määrata visuaalse vaatluse teel.
Reportergeenid on näiteks:
4. Transformatsioon - geeni ülekandmine taime
Vektorit, kus on nii huvipakkuv geen, markergeen, kui ka reportergeen, on võimalik taime viia mitut moodi. Kaks peamist meetodit on mullabakteri Agrobacterium tumefaciens abil või elektri abil (kasutades biolistikat).
Mullabakter
Mullabakter Agrobacterium tumefaciens on taime patogeen ning tekitab vigastatud kaheidulehelistel taimedele kalluskasvajaid. Ta sisaldab Ti-plasmiidi (tumor-inducing plasmid), mis võimaldab taime genoomi sisestada osa enda DNA-st. Sõltuvalt bakteri tüvest, sisaldab see DNA lõik infot, et sünteesida nopaliini, oktapiini, suktsinamopiini või leukinopiini. Kõiki neid molekule kasutavad bakterid energiaallikana. Video demonstreerib, kuidas nakatab agrobakter taime: http://www.ppws.vt.edu/~sforza/agro/agro.html
1970-1983 mõtlesid kaks Belgia teadlast Marc Van Montagu ja Jozef Schell välja süsteemi, kuidas muuta Ti-plasmiidi nii, et see viiks taime DNA lõigu, mis oleks inimese poolt valitud. Allpool olev video demonstreerib seda süsteemi.
Geenitehnoloogia abil uute omadustega taime loomiseks on vaja läbida 5 etappi:
1. DNA eraldamine
Kui on tuvastatud huvipakkuva omaduse (näiteks herbitsiidi resistentsuse) eest vastutav geen, siis on vaja sellest organismist eraldada kogu DNA või RNA. Alternatiiviks on kasutatada arvuteid ja moodsaid DNA sünteesi masinaid ning sünteesida DNA ise. Viimase võimalikkust on näidanud C. Venter, kes sünteesis mükoplasma (Mycoplasma genitalium) DNA (Gibson et al 2008).
2. Huvipakkuva geeni kloneerimine ehk viimine kandjamolekuli
Eelnevas etapis saadud DNA-st lõigatakse restriktsiooni ensüüme kasutades välja üks konkreetne geen, mis vastutab konkreetse tunnuse eest. See DNA lõik 'kleebitakse' vektorisse. Vektor on DNA molekul, mida kasutatakse geneetilise materjali kandjana. Vektoreid on neli tüüpi:
- Plasmiid
- Bakteri või viiruse faag
- Kosmiidid
- Kunstlikud kromosoomid BAC, YAC)
- molekuli paljundamise alguskohta OriC (Origin of replication)
- multikloneerimise kohta (multiple cloning site)
- marker geen
3. Geeni ekspressiooni disain
Vastavalt soovitud eesmärgile on võimalik ära määrata geeni ekspressiooni muster taimes: millal ja millistes taime osades ning millises mahus toimub valitud tunnuse ilmnemine. Seda tehakse promootori abil.
--Promootor - DNA lõik, mis määrab ära geeni ekspressiooni aja ja koha.
Konstitutiivne promooter – ekspressioon toimub kogu aeg igas taime osas.--
Valikuline promooter – ekspressioon toimub ainult teatud taime arengu faasides, teatud taime kudedes või sõltub ekspressioon välistest teguritest.
—Tugevad ja nõrgad promootorid – mõjutavad ekspressiooni kogust (valgu hulka taimes)—.
Selleks, et oleks võimalik jälgida sisseviidava geeni liikumist taimes on vaja veel kahte DNA lõiku: markergeeni ja reportergeeni.
Markergeen - DNA lõik, mille alusel saab otsustada, kas huvi all olev geen on teise organismi kandunud. Klassikaliselt on selleks antibiootilist resistentsust tagavad geenid (näiteks ampitsilliini või kanamütsiini resistentsuse geenid). Aga kuna meditsiinis kasutusel olevate antibiootikumide resistentsuse geeni levik looduses võib tekkida probleeme, siis suund on võtta kasutusele teisi markereid. Näiteks kasutatakse herbitsiidi resistentsuse geeni või taime ainevahetuse geene (phosphomannose isomerase, xylose isomerase etc).
Markergeen viiakse huvipakkuva geeniga samas vektoris taime rakkudesse. Rakud pannakse kasvama antibiootikumi või herbitsiidi sisaldavasse söötmesse ja need mis jäävad ellu, on tõenäoliselt edukalt üle võtnud nii marker geeni, mis andis rakkudele resistentsuse, kui ka huvipakkuva geeni.
Juba suureks kasvanud taimes on vaja samuti kontrollida, et huvipakkuv geen oleks taimes ning et geen oleks funktsionaalne (valgu süntees toimiks). Sellise kontrolli võimalust pakub reportergeen.
Reportergeen - DNA lõik, mille ekspressiooni on võimalik taimes määrata visuaalse vaatluse teel.
Reportergeenid on näiteks:
- Beta glucuronidase gene (gusA gene) – toodab sinist molekuli (transformeerunud rakud on sinised)
- Roheline fluorestseeruv valk (green fluorecent protein - gfp) – rakud helendavad rohelise valguse käes
- Lutsiferaas (luciferase) – jaanimardikast – rakud helendavad pimedas
4. Transformatsioon - geeni ülekandmine taime
Vektorit, kus on nii huvipakkuv geen, markergeen, kui ka reportergeen, on võimalik taime viia mitut moodi. Kaks peamist meetodit on mullabakteri Agrobacterium tumefaciens abil või elektri abil (kasutades biolistikat).
Mullabakter
Mullabakter Agrobacterium tumefaciens on taime patogeen ning tekitab vigastatud kaheidulehelistel taimedele kalluskasvajaid. Ta sisaldab Ti-plasmiidi (tumor-inducing plasmid), mis võimaldab taime genoomi sisestada osa enda DNA-st. Sõltuvalt bakteri tüvest, sisaldab see DNA lõik infot, et sünteesida nopaliini, oktapiini, suktsinamopiini või leukinopiini. Kõiki neid molekule kasutavad bakterid energiaallikana. Video demonstreerib, kuidas nakatab agrobakter taime: http://www.ppws.vt.edu/~sforza/agro/agro.html
1970-1983 mõtlesid kaks Belgia teadlast Marc Van Montagu ja Jozef Schell välja süsteemi, kuidas muuta Ti-plasmiidi nii, et see viiks taime DNA lõigu, mis oleks inimese poolt valitud. Allpool olev video demonstreerib seda süsteemi.
Biolistika – DNA viimine taimerakku volframi-või kullaosakeste pinnal. Osakeste sisestamiseks kasutatakse nn. geenipüss (gene gun). Tehniliselt võib abivahendiks olla suruõhk või –heelium või kõrgvool. Geenipüssi mõtles välja taime geneetik Dr. John C. Sanford 1980 aastatel.
Eelised: sobib kõigile taimeliikidele; pole vaja binaarset DNA vektorit; protokoll on lihtne.
Puudused: keeruline on saavutada ühe geenikoopia ülekandumist (single copy transgenic events); kallis tehnika; geeni sisenemise koht on juhuslik (tsütoplasma, tuum, vakuool, plastiid…).
Video annab ülevaate biolistikast neuronite näitel.
Animatsioon taimes:
5. Järelkontroll
—Sisestatud geeni olemasolu kontrollimine molekulaarbioloogia meetodite abil.
—PCR (polymerase chain reaction) - polümeraasi ahelreaktsioon - biokeemiline meetod molekulaarbioloogias, mis võimaldab ühest DNA fragmendist luua tuhandeid koopiaid. Selle meetodi abil saab kindlaks teha, kas valitud geen on sisenenud taime genoomi.
—Southern blot - meetod, millega saab testida, kas sisestatud geen on terve ja ‘ühes tükis’, õiges suunas (orientation) ning määrata, mitu korda on geen taime genoomi sisenenud (koopia arv).
Northern blot - —meetod, millega saab testida, kas mRNA on taimes olemas. mRNA olemasolu tõestab, et uus geen on taimes aktiivne ja transkriptsioon toimib korrektselt.
Western blot - meetod, millega saab testida valgu olemasolud taimes. Valgu olemasolu näitab uue geeni täit funktsionaalsust taimes.
6. Tagasiristamine
Kui huvipakkuv geen on edukalt taime viidud, siis on võimalik alustada ristamistega, et saada tööstuslikul tasemel kasvatatav taim.